Химерный антигенный рецептор

Составные части химерного рецептора антигена. CAR состоят из внеклеточного антигенраспознающего фрагмента, который связан, с помощью спейсера-шарнира и трансмембранного домена, с внутриклеточным доменом сигнализации (зелёный), который может состоять из костимулирующего домена и участка Т-клеточной активации.

Химерный рецептор антигена (англ. Chimeric antigen receptor или сокращенно CAR) — это рекомбинантный гибридный белок, сочетающий фрагмент антитела, обладающий способностью очень избирательно связываться с конкретными антигенами, с сигнализирующими доменами, способными активировать Т-клетки. Поскольку такой гибридный белок состоит из частей, полученных из разных источников, его называют химерным. Иммунные эффекторные клетки, имеющие сконструированные таким образом CAR, приобретают высокую селективность за счёт добавленного извне рецептора от моноклонального антитела.

Технология CAR позволяет перепрограммировать собственные иммунные клетки пациента за пределами его тела, с тем чтобы создать CAR, позволяющий охотиться на раковые клетки и эффективно разрушать опухоли у пациента. Полученные клетки CAR затем используют для так называемой адоптивной иммунотерапии — разновидности иммунотерапии рака.

Обычно CAR состоят из внеклеточного антигенраспознающего фрагмента, который связан, с помощью спейсера-шарнира и трансмембранного домена, с внутриклеточным доменом сигнализации, который может состоять из костимулирующего домена и участка Т-клеточной активации.

CARs опознают антигены не только по основным антигенам гистосовместимости, что и отличает их от физиологических Т-клеточных рецепторов (ТКР). Поэтому CAR-Т-клетки могут преодолеть некоторые из основных механизмов, посредством которых опухолям удаётся избежать опознания их Т-клеткой по антигенам гистосовместимости

Ещё одной особенностью CARs является их способность связывать не только белки, но и углеводы, ганглиозиды, протеогликаны, а также гликозилированные белки, тем самым расширяя спектр потенциальных целей.

Конструкции химерных рецепторов антигена. Химерные рецепторы антигена (CAR) сочетают вариабельные участки антиген-распознающих доменов (ScFv) из моноклональных антител с участками доменов внутриклеточной сигнализации Т-клеток. В рецепторах первого поколения используется цепь CD3ζ из комплекса Т-клеточного рецептора (TCR), в то время как рецепторы второго и третьего поколения включают, соответственно, ещё и один или два костимулирующих сигнализатора, которые, обычно получают из молекул семейства В7 (CD28, ICOS) и/или суперсемейства TNF (4-1ВВ, OX40, CD27).

Универсальная CAR-T-клетка может быть использована против множества различных раковых антигенов, распознаваемых с помощью множества малых адапторных молекул, содержащих один и тот же, распознаваемый рецептором CAR-T-клетки участок.

В дополнение к антиген-специфическому связыванию, разработаны так называемые «универсальные системы CAR». Так например, разработаны CAR, связывающие авидин, что позволило использовать единожды полученный CAR не против одного антигена, ассоциированного с опухолью, а против бесчисленного множества различных антигенов, распознаваемых с помощью различных антител, модифицированных биотином, что позволяет выявлять их авидином (реакция авидин-биотин). Аналогичным образом устроена универсальная система CAR, связывающая флуоресцеинизотиоцианат (FITC) Универсальная система CAR названная "SUPRA CAR" состоит из двух модулей: универсального рецептора (zipCAR) и адаптерного модуля scFv распознающего антиген опухоли (zipFv). Универсальный рецептор zipCAR образуется в результате слияния внутриклеточных сигнальных доменов и лейциновой "застежки-молнии" (zipper) в качестве внеклеточного домена. Молекула адаптера zipFv состоит из домена узнающего и соединяющегося с лейциновой "застежкой-молнией" и домена scFv. ScFv молекулы zipFv связывается с опухолевым антигеном, а лейциновая молния связывает и активирует zipCAR на иммунных клетках. Модуль универсального рецептора zipCAR может быть расположен на различных типах клеток: на T-лимфоцитах с CD4+ и CD8+ корецепторами Т-клеточных рецепторов; на регуляторных Т-клетках, а также на NK-клетках. Множество различных zipFv молекул позволяет легко и быстро перенастраивать систему на новые антигены без необходимости заново конструировать CAR-Т-клетки.

При терапии с помощью CAR-Т-клеток возможны осложнения в виде синдрома высвобождения цитокинов, в частности повышение уровня интерлейкина 6 и интерлейкина 2. Система SUPRA CAR даёт возможность быстро остановить развитие синдрома высвобождения цитокинов так как позволяет добавить при необходимости конкурентные zipFv, что защитит zipCAR от активации

Использование CAR-модифицированных клеток для терапии рака

В течение многих десятилетий большинство видов рака лечили по стандартному набору терапевтических подходов, в числе которых были хирургия, радиационная терапия и химиотерапия. Теперь этот список дополнила иммунотерапия — тип лечения, который для борьбы с заболеванием использует иммунную систему пациента. Повышению значимости иммунотерапии для лечения рака способствовала разработка CAR-модифицированных T-клеток, нацеленных на раковые антигены. Так например, были разработаны CAR, направленные против подопланина (PDPN), белка, который, как правило, в изобилии содержится в солидных опухолях, в том числе в клетках глиобластомы наряду с, вызванной делецией, мутантной формой рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) — белком EGFRvIII, а также против эпитопа Tn муцина MUC1 опухолевого антигена, обнаруженного при различных карциномах, что позволило (пока в опытах на мышах) успешно лечить эти заболевания.

К сожалению, в случае, когда здоровые ткани имеют те же целевые антигены, что и опухолевые клетки, терапия с помощью CAR, направленная на подобный антиген, может вызвать значительный токсический эффект. Кроме того, CD4⁺-Treg-клетки подавляют эффективность клеточной терапии CAR-Т. Поэтому нужно тщательно подбирать клоны CAR-Т. CAR-Т-клеточные продукты, полученные из хорошо подобранных клонов Т-клеток, имеют значительно более высокую эффективность по сравнению с продуктами, полученными из неотобранных Т-клеток, которые различаются по фенотипическому составу. Поэтому селекция и отбраковка имеют важное значение для разработки CAR-Т, где синергично сочетается противоопухолевое действие самых мощных фенотипов CD4⁺- и CD8⁺-клонов..

Снизить токсический эффект CAR на здоровые ткани можно также с помощью CAR, сконструированных так, что синтетический рецептор Notch для одного антигена индуцирует экспрессию CAR для второго антигена. Такие Т клетки с двухрецепторным «замком-затвором» способны активироваться только в отношении опухолевых клеток, имеющих оба антигена, что повышает их избирательность в отношении именно опухолевых клеток

Поскольку характерной особенностью примерно 50 % твёрдых опухолей является гипоксическая среда, были спроектированы Т-клетки CAR, которые реагируют на гипоксическую среду — они неэффективны, если не находятся в гипоксической среде. С этой целью к ним добавлен субдомен HIF1α (hypoxia-inducible factor 1-alpha). Введение «датчика опухолевого микроокружения» обеспечивает дополнительный уровень безопасности за счёт сведения к минимуму внецелевого действия Т-клетки CAR. Другой способ сведения к минимуму внецелевого действия Т-клетки CAR, (называемый CytomX Probody-технология), заключается в «маскировании» (блокировке) распознающего мишень участка антитела до тех пор пока Т-клетка CAR не попадёт в опухоль, где её маскировка будет удалена протеазой, уникальной для микроокружения опухоли.

В последние годы Т-клетки CAR были применены для лечения примерно 1 тысячи пациентов с поздними стадиями лейкозов и лимфом. Более половины из них до сих пор живы, а сотни полностью излечились.

Использование CAR-модифицированных клеток для предотвращения аутоиммунных реакций

Предотвращение реакции отторжения трансплантата

Использование терапии химерными анти-CD40-антителами, предотвращая активацию гуморальных механизмов отторжения и дисрегуляцию путей регуляции свёртывания крови, позволило ксенотрансплантату сердца свиньи проработать в теле у примата (бабуина) 945 дней. Подобные подходы в конечном счёте могут быть использованы и для трансплантации органов в организм человека, что очень актуально, учитывая острую нехватку пригодных для трансплантации органов.

Регуляторные Т-клетки (Tregs) играют существенную роль в предотвращении аутоиммунитета, и в частности в профилактике реакции отторжения трансплантата, препятствующей успешной трансплантации органов. Применение регуляторных Т-клеток в клинической практике было ограничено крайне низким количеством этих клеток в периферийной крови и поликлональности — отсутствия у их популяции узкой направленности (из-за чего можно было вызвать нежелательное общее понижение иммунитета человека). Был разработан метод трансдукции регуляторных Т-клеток человека с помощью CAR, который нацелен на молекулу А2 человеческого лейкоцитарного антигена класса I. Использование химерных антигенных рецепторов HLA-A2-CAR, в которых регуляторные Т-клетки, генетически сконструированы для экспрессии внеклеточных одноцепочечных Ab (ScFv — Single-chain variable fragment) антиген-связывающих доменов, поможет защитить пересаженные ткани и органы от отторжения иммунной системой пациента.

Терапия аутоиммунных заболеваний

Разработана стратегия лечения аутоиммунных заболеваний с помощью химерного рецептора аутоантител CAAR (англ. chimeric autoantibody receptor), который нацеливает T-клетки на уничтожение аутореактивных В-клеток. Так, например, спроектированы человеческие Т-клетки, синтезирующие CAAR, состоящий из аутоантигена (в данном случае десмоглеина Dsg3), слитого с сигнальным доменом CD137-CD3ζ, который активирует T-клетки. Такие Dsg3-CAAR-T-клетки проявляют избирательную цитотоксичность против В-клеток, экспрессирующих анти-Dsg3 и поэтому способны избирательно устранить Dsg3-специфические В-клетки in vivo, не затрагивая при этом другие В-клетки .

Технология ускоренного выращивания CAR

Внедрение последовательности Strep-tag II (пептидной последовательности из восьми остатков (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys), которая проявляет сродство к стрептавидину) в определённом участке CAR позволило использовать эту последовательность в качестве маркера для идентификации и быстрого выделения. С помощью специального антитела, которое связывается с Strep-tag, сконструированные клетки можно быстро размножить в 200 раз. При этом 95 % клеток содержат CAR (тогда как обычно число таких клеток не превышало 43 %)

CAR T-клетки секретирующие IL-18

Провоспалительный цитокин интерлейкин 18 (IL-18) обладает способностью увеличивать активность клеток ЕК в селезёнке, индуцировать экспрессию интерферона-γ (IFN-γ), а также активировать лимфоциты и моноциты, не вызывая при этом сильную дозозависимую токсичность. Поэтому были созданы IL-18-секретирующие T клетки с химерным рецептором антигена (IL-18-CAR T), что позволило значительно увеличить пролиферацию CAR T клеток и противоопухолевую активность организма.

Универсальные CAR T-клетки, устойчивые к ингибированию PD1

С помощью тройного редактирования генома удалось создать CAR-T-клетки, у которых снижена «аллореактивность» — они не вызывают болезни «трансплантат против хозяина» и имеют повышенную противоопухолевую активность, так как устойчивы к ингибированию воздействием опухоли на PD1 (programmed cell death protein 1). Как известно, опухоли, воздействуя на ген PD1, способны предотвращать атаку на них иммунных клеток, поэтому, если иммунным клеткам не хватает PD1, то раковые клетки не могут ими манипулировать. Есть, однако, риск того, что такие иммунные клетки «без тормозов» могут начать атаковать и здоровые клетки. Эта разработка будет способствовать широкому внедрению в клинику технологии CAR, поскольку если до сих пор CAR-T-клетки создавали для каждого пациента персонально, что было очень дорого, сложно и требовало много времени, то с внедрением новой технологии процесс подбора CAR-T-клеток станет значительно проще.

Разработана также технология, использующая полимерные наночастицы для переноса в ядра Т-клеток ДНК с генами, нацеливающими CAR. Эти полимерные наночастицы просты в изготовлении и достаточно стабильны, что упрощает их хранение и снижает их стоимость. Имея заранее заготовленную «библиотеку» таких наночастиц, можно быстро перепрограммировать специализацию CAR. Более того, авторы утверждают, что их технология позволяет проводить перепрограммирование in situ, просто вводя наночастицы, нацеленные на Т-клетки в кровотоке.

CAR-T-NKR-2-клетки

Фирма Celyad CAR-T создала принципиально новые CAR-T-NKR-2-клетки. В отличие от метода scFv-антител, используемого «классическим» CAR-T, Celyad CAR-T использует, как первичный рецептор в Т-клетках, для распознавания опухолевого антигена рецептор, состоящий из продукта полноразмерного нативного человеческого NKG2D-гена, слитого с цитоплазматическим сигнальным доменом нативного человеческого CD3ζ. NKG2D является нормальным человеческим белком, который играет важную роль в защите человеческого организма от инфекций и рака. Лиганды к рецепторному белку NKG2D в норме не синтезируются. Они появляются на поверхности клетки лишь в случае стрессовых ситуаций, таких как вирусная инфекция, окислительный стресс, генотоксические препараты, повреждение тканей, тепловой шок, действие воспалительных цитокинов и главным образом при злокачественной трансформации. Важно отметить что этот рецептор распознаёт порядка 80 % всех раковых клеток (как солидные опухоли, так и различные виды рака крови), что значительно расширяет диапазон его использования. Клинические испытания в фазе 1а показали что препарат безопасен для человека

«Готовый» ресурс для лечения рака представляют собой, полученные из ИПСК человека оптимизированные NK-клетки с трансмембранным доменом NKG2D (NK-CAR-iPSC-NK cells). Отмечается что они менее токсичны чем обычные CAR-T и при этом дольше живут в организме

CAR-макрофаги

Известно что макрофаги могут поглощать и убивать клетки в процессе фагоцитоза. Новым подходом к терапии солидных (лат. solidus — твёрдый) опухолей, которые плохо поддавались терапии CAR-T-клетками, является попытка использовать макрофаги, генетически модифицированные добавлением химерного рецептора антигена, чтобы специально направлять их к опухолевым клеткам. Предполагается, что CAR-макрофаги — CARMA (Сhimeric antigen receptor macrophages) помогут лечить метастатические солидные опухоли.

Неиммунные клетки, перепрограммированные в аналоги Т-клеток

С целью упрощения и удешевления технологии получения Т-клеток, исследователи создали синтетические клетки, имитирующие Т-клетки. Для этого они перепрограммировали клетки человеческих почек (которые можно извлечь из мочи) и стволовые клетки, получаемые липосакцией. Эти синтетические клетки оснащены сигнальным механизмом, который состоит из молекулярных антенн и антител которые могут распознавать целевые структуры раковой клетки, а также имеют генетический механизм, который генерирует ферментный комплекс, разрушающий мембрану клетки-мишени, и фермент который преобразует противораковое вещество проникшее во внутреннюю часть опухолевой клетки из неактивного предшественника (препарата, который должен быть добавлен в организм извне) в активное состояние. В результате раковые клетки разрываются, активное вещество высвобождается и разрушает другие опухолевые клетки в «зоне смерти» вокруг синтетической Т-клетки.

Появилась технология позволяющая производить CAR Т клетки в промышленных масштабах из генетически модифицированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Готовые линии таких клеток можно бесконечно долго размножать в качестве не дорогого лекарственного препарата. Перед употреблением такие модифицированные ИПСК клетки превращают в зрелые CAR Т клетки с помощью искусственного органоида тимуса, который работает, имитируя среду тимуса, органа, в котором Т-клетки развиваются из стволовых клеток крови.

См. также

• Т-клеточный рецептор — (англ. TCR)
• Иммуноонкология